pulldown是什么意思 down实验步骤

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Pulldown实验是一种广泛用于检测或确认多种蛋白质之间相互作用的体外方法[1]。该方法类似于免疫共沉淀实验，使用亲和配体捕获相互作用蛋白。这两种方法的不同之处在于，免疫共沉淀使用固定抗体来捕获蛋白质复合物，而Pulldown方法使用纯化和标记的蛋白质作为“诱饵”来结合任何相互作用的蛋白质[2]。

该方法包括首先将标记的蛋白质(诱饵)固定在标签特异性的亲和配体上，产生亲和支持，以捕获和纯化与诱饵相互作用的其他蛋白质(猎物)。诱饵和猎物蛋白可以从多种来源获得，例如细胞裂解物、纯化蛋白、表达系统和体外转录/翻译系统。一旦猎物蛋白与固定化诱饵蛋白一起孵育，可以根据亲和配体的不同，使用洗脱缓冲液洗脱相互作用复合物。每个实验都需要适当的控制来证明具有特征的相互作用不是人为的。Pulldown实验后，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)解析蛋白质组分，然后通过凝胶染色或western-blot检测可视化[3]。

1.将真核细胞置于细胞培养皿中，在37℃CO2培养箱中孵育过夜。

2.用含有目标基因的质粒和适当的转染试剂转染细胞，以获得最佳表达蛋白所需的时间（16-24h通常是一个很好的范围）。

3.将培养皿放在冰上冷却细胞，用1倍PBS洗涤细胞。加入2ml预冷的PBS，用细胞刮刀收集细胞。

6．在冰上孵育20分钟，每5分钟轻轻混合一次。

8.在Pulldown实验之前，解冻准备好的细胞提取物。4°C,17000×g离心20分钟。使用上清液作为猎物。

3.2以细胞裂解液为猎物的Pulldown试验。

1.将120μLNi-NTA琼脂糖珠转移到重力流柱上。

5.50μghis标记的蛋白(诱饵)与400μL平衡缓冲液混合，上样于柱上。

6.在4°C搅拌下孵育1小时，在冰上静置10分钟。

8.将200μL细胞提取液与200μL平衡缓冲液混合，上样于色谱柱。

9.在4°C搅拌下孵育1小时，然后在冰上静置10分钟。

10.4°C,1000×g离心1min。保持流动以供分析。

11.向柱中加入400μL平衡缓冲液洗涤柱。

13.向柱中加入含有50mM咪唑的平衡缓冲液400μL洗涤柱。保留第一次洗涤用于分析。

15.重复步骤14和15三次，然后进行步骤16。将最后的洗涤液保存在4°C以供分析。

16.将80μL洗脱缓冲液加载到柱上，在4°C下孵育10分钟。

17.4℃，1000×g离心1min，保留洗脱后的馏分。

18.用洗脱的馏分重复步骤16和17。将洗脱的馏分保持在4°C进行分析。

3.3使用纯化蛋白作为猎物的Pulldown试验

1.50μghis标记的诱饵蛋白与50μg纯化的猎物蛋白在400μL平衡缓冲液的总体积中孵育2.5h，在4°C搅拌下孵育。

2.向重力流柱中加入80μLNi-NTA琼脂糖珠.

3.用加有20mM咪唑的400μL平衡缓冲液平衡柱子。

5.将400μL孵育的诱饵和猎物蛋白上柱。在冰上静置孵育10分钟。

6.4°C,1000×g离心1min。在4°C下保持流动以进行分析。

7.柱中加入400μL平衡缓冲液，外加20mM咪唑洗涤。

8.4°C,1000×g离心1min。4°C保存第一次洗涤液用于分析。

9.重复洗涤步骤7和8四次，并将最后洗涤液保存在4°C以供分析。

10.柱中加入200μL洗脱缓冲液，冰上孵育10分钟。

11.4°C,1000×g离心1min。洗脱后的馏分保存在4°C进行分析。

1.对15μL蛋白馏分加入5μL裂解缓冲液，4倍浓缩。100℃加热3min，用微离心机离心30s，取下凝析液。

2.在SDS——聚丙烯酰胺凝胶上上样10μL洗脱蛋白和5μL蛋白maker。

3.电泳蛋白在100V下运行缓冲液15分钟，然后180V，直到染料前端到达凝胶底部。

4.通过免疫检测或蓝色考马斯色法鉴定相互作用蛋白[1]。

卡梅德生物（KMDBioscience）(https://www.kmdbioscience.cn/)多年致力于蛋白相互作用研究，卡梅德生物坚持为客户提供高品质的服务内容，能够提供从重组蛋白制备到pulldown蛋白互作检测等一站式技术服务，满足不同客户的需求。

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